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黑异纹魮脂鲤微卫星标记位点及其在本属和近源属鱼类通用性应用

2022-05-07 18:19      点击次数:

本发明属于生物技术检测领域,更具体地说,涉及黑异纹魮脂鲤微卫星标记位点及其在魮脂鲤属和直线脂鲤属部分物种之间的通用性应用。 魮脂鲤属(hyphessobrycon)与直线脂鲤属(moenkhausia)在分类上均隶属于鲤形目(cypriniformes),脂鲤亚目(characoidei),脂鲤

  本发明属于生物技术检测领域,更具体地说,涉及黑异纹魮脂鲤微卫星标记位点及其在魮脂鲤属和直线脂鲤属部分物种之间的通用性应用。

  魮脂鲤属(hyphessobrycon)与直线脂鲤属(moenkhausia)在分类上均隶属于鲤形目(cypriniformes),脂鲤亚目(characoidei),脂鲤科(characidae),大部分原产于南美洲亚马逊河、非洲刚果河流域等热带水域中,多为颜色艳丽、易于饲养的热带观赏鱼,其中个头较小的品种被称为“灯鱼”,于上个世纪中后期被引入国内,称为受人欢迎的观赏鱼类。其中魮脂鲤属约57种,直线种。其中不乏有爱泳魮脂鲤、黑异纹魮脂鲤、科斯塔氏直线脂鲤等家喻户晓的观赏鱼种。

  黑异纹魮脂鲤(hyphessobryconherbertaxelrodi)在分类上隶属鲤形目(cypriniformes),脂鲤亚目(characoidei),脂鲤科(characidae),魮脂鲤属(hyphessobrycon)。分布于南美洲巴西亚马逊河下游沿岸热带原始森林间的水域中。黑异纹魮脂鲤躯体较小、色彩艳丽、性情温顺、容易饲养,深受世界各地观赏鱼业的青睐。属于草上卵生鱼类,排出的卵具有黏性,受精卵需要附着在水草等附着物上孵化。

  如今,有很多国家开始对部分热带观赏鱼进行商业繁殖,以期获得更多数量的个体,减少野生资源的采集,为了快速有效的鉴别不同的以黑异纹魮脂鲤为代表的魮脂鲤属和直线脂鲤属物种的家系及来源,对其微卫星引物的开发尤为重要。

  微卫星(simplesequencerepeat,ssr)广泛分布于真核生物的基因组中,其符合孟德尔遗传模式,具有共显性表达、多态性信息丰富、种间通用性强、易于检测等优点。因此作为一种先进的分子标记手段,广泛应用于鱼类种群遗传多样性调查、亲本选择、亲缘关系鉴定和分子标记辅助育种等生产领域。如今,有很多国家开始对部分热带观赏鱼进行商业繁殖,以期获得更多数量的个体,减少野生资源的采集,为了快速有效的鉴别不同的以黑异纹魮脂鲤为代表的魮脂鲤属和直线脂鲤属物种的家系及来源,对其微卫星引物的开发尤为重要。而目前,关于上述物种的微卫星分子标记的开发应用尚不多见。

  目前,微卫星荧光标记全自动基因分型技术已被普遍采用,利用不同颜色的荧光染料标记微卫星dna引物,可以精确计算出微卫星等位基因片段大小。本法具有产量高、成本低、快速简便等优点,显示了广阔的应用前景。本实验通过筛选黑异纹魮脂鲤高度多态性微卫星位点,为黑异纹魮脂鲤的遗传学检测奠定了基础,并从中选出部分通用性微卫星位点,为玫瑰魮脂鲤、爱泳魮脂鲤、索氏魮脂鲤、大鳍魮脂鲤和科斯塔氏直线脂鲤五个物种的遗传学检测奠定了基础。

  针对现有技术存在的上述问题,本发明所要解决的技术问题在于提供黑异纹魮脂鲤5个微卫星分子标记位点及其多态性引物,为黑异纹魮脂鲤的遗传多样性以及种群间的亲缘关系的鉴定提供资料,弥补现有技术的不足。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述5个微卫星分子标记位点在玫瑰魮脂鲤、爱泳魮脂鲤、索氏魮脂鲤、大鳍魮脂鲤和科斯塔氏直线脂鲤中的通用性应用。

  本发明利用dna小片段文库测序技术从黑异纹魮脂鲤基因组dna中筛选出5个微卫星位点,标记编号为hy-01、hy-02、hy-03、hy-04、hy-05。

  所述的黑异纹魮脂鲤微卫星分子标记hy-01、hy-02、hy-03、hy-04、hy-05或其组合在黑异纹魮脂鲤的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方面的应用。

  所述的黑异纹魮脂鲤微卫星分子标记hy-01、hy-02、hy-04、hy-05或其组合在大鳍魮脂鲤的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方面的应用。

  所述的黑异纹魮脂鲤微卫星分子标记hy-02、hy-04、hy-05或其组合在玫瑰魮脂鲤的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方面的应用。

  所述的黑异纹魮脂鲤微卫星分子标记hy-02、hy-03、hy-04、hy-05或其组合在爱泳魮脂鲤的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方面的应用。

  所述的黑异纹魮脂鲤微卫星分子标记hy-01、hy-02、hy-03、hy-04、hy-05或其组合在索氏魮脂鲤的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方面的应用。

  所述的黑异纹魮脂鲤微卫星分子标记hy-02、hy-04、hy-05或其组合在科斯塔氏直线脂鲤的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方面的应用。

  本发明微卫星位点引物是从hy01-05微卫星两端的侧翼序列上设计的正向(f)、反向引物(r),微卫星引物序列分别是seqidno.06-15。

  黑异纹魮脂鲤的5个通用微卫星位点的核心重复序列、引物序列、荧光标记及其最佳退火温度信息如表1所示:

  表1黑异纹魮脂鲤微卫星位点的核心重复序列、引物序列、荧光标记及其最佳退火温度

  本发明的微卫星多态性引物用于黑异纹魮脂鲤及其部分同属和近源属物种遗传多样性检测,包括以下步骤:

  1)基因组dna的提取:采用南京诺唯赞生物科技有限公司dna提取试剂盒;

  2)微卫星pcr扩增:采用fam、hex、tamra荧光标记的微卫星引物扩增黑异纹魮脂鲤基因组dna,获得其扩增产物;

  3)遗传多样性分析:根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小取定基因型,利用cervus3.0.7计算遗传多样性参数。

  4)跨物种微卫星pcr扩增:采用fam、hex、tamra荧光标记的微卫星引物扩增玫瑰魮脂鲤、爱泳魮脂鲤、索氏魮脂鲤、大鳍魮脂鲤和科斯塔氏直线脂鲤的基因组dna,获得其部分扩增产物。

  5)跨物种遗传多样性分析:根据对步骤4)中五种物种个体微卫星扩增产物分子量大小取定基因型,利用cervus3.0.7计算遗传多样性参数。

  本发明利用dna小片段文库测序技术获得黑异纹魮脂鲤的dna小片段,根据相似度高的模板序列利用geneiousprime软件拼接得到dna大片段,通过寻找简单重复序列找到适量的潜在的微卫星位点。dna小片段文库测序技术与其他高通量测序技术相比价格低廉,获得的小片段不仅可以从中寻找适量微卫星位点,同时可以拼接该物种的线粒体环等dna大片段,应用范围广、数据可以重复利用、降低实验成本。从上述潜在的微卫星位点中筛选5个微卫星位点,根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物,使用所获得引物的扩增结果具有多态性和稳定性,可适用于黑异纹魮脂鲤种群遗传多样性检测,个体鉴定以及分子辅助育种领域,为黑异纹魮脂鲤的微卫星多态性检测奠定坚实的基础。

  (1)提取黑异纹魮脂鲤的dna:从南京夫子庙花鸟市场和天津宝鸡道花鸟市场采集26条黑异纹魮脂鲤样本,保存于无水乙醇中,采用南京诺唯赞生物科技有限公司dna提取试剂盒进行dna提取,具体步骤如下:

  使用干净的剪刀将鱼尾鳍剪碎转入离心管中,加入230μlbufferga和20μlpk工作液,涡旋混匀。用55℃水浴至组织完全酶解。加入250μlbuffergb至消化液中,最高速度涡旋混匀20sec,70℃水浴10min。再加入250μl无水乙醇至消化液中,手动离心15-20sec。将gdnacolumns吸附柱置于collectiontubes2ml收集管中。将上一步所得混合液(包括沉淀)转移至吸附柱中。12,000×g离心1min。弃滤液,将吸附柱置于收集管中。加入500μlwashingbuffera至吸附管中。12,000×g离心1min。弃滤液,将吸附柱置于收集管中。加入650μlwashingbufferb至吸附柱中。12,000×g离心1min。重复一次,弃滤液,将吸附柱置于收集管中。12,000×g空管离心2min。将吸附柱置于新的1.5μl离心管。加30-100μl余热至70℃的elutionbuffer至吸附柱的膜中央,室温放置3min。12,000×g离心1min。弃掉吸附柱,将dna保存在2-8℃。

  根据墨西哥丽脂鲤(astyanaxmexicanus)全基因组序列,利用geneiousprime软件将dna小片段文库测序技术获得的黑异纹魮脂鲤dna小片段拼接成dna大片段,通过gramene网站查找简单重复序列,得到适量的微卫星位点,通过一代扩增后筛选可用的微卫星位点。微卫星筛选主要依据为:该微卫星位点能否得到扩增结果;扩增结果是否为原微卫星序列。最终筛选出5个微卫星位点,并在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物,得到5对微卫星引物。

  将步骤(2)筛选得到的5对微卫星引物,正向引物用不同荧光物质标记,其中hy-01的荧光标记为hex,hy-02、hy-04、hy-05的荧光标记为fam,hy-03的荧光标记为tamra,利用这些荧光引物对步骤(1)获得的黑异纹魮脂鲤dna样品进行pcr扩增。其pcr反应体系为:7.5μl2×premixtaqtm、1μl模板基因组dna、上下游引物各0.5μl、5.5μlddh2o,pcr扩增程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,55-60℃退火30s,72℃延伸30s,进行30个循环;最后72℃再延伸5min。采用软件cervusv.3.0.7中allelefrequencyanalysis计算各微卫星标记的等位基因数(na)、期望杂合度(he)和多态信息含量(pic),结果表明每个微卫星位点的等位基因数目均为3个,期望杂合度(he)的范围从0.242到0.541,多态信息含量(pic)的范围从0.217到0.438,详细结果展示在表2中。

  根据步骤(1)所述方法,提取玫瑰魮脂鲤、爱泳魮脂鲤、索氏魮脂鲤、大鳍魮脂鲤和科斯塔氏直线脂鲤的基因组dna。将步骤(2)筛选得到的5对黑异纹魮脂鲤微卫星引物通过步骤(3)所述方法对以上五种物种的基因组dna进行pcr扩增。采用软件cervusv.3.0.7中allelefrequencyanalysis计算各微卫星标记的等位基因数(na)、期望杂合度(he)和多态信息含量(pic),结果表明:

  b、可在玫瑰魮脂鲤(hyphessobryconrosaceus)基因组dna中扩增的微卫星位点共有3个,即hy-02、hy-04、hy-05,每个微卫星位点的等位基因数目从4-5个不等,期望杂合度(he)的范围从0.350到0.725,多态信息含量(pic)的范围从0.313到0.641,详细结果展示在表4中。

  e、可在科斯塔氏直线脂鲤(moenkhausiacostae)基因组dna中扩增的微卫星位点共有3个,即hy-02、hy-04、hy-05,每个微卫星位点的等位基因数目从2-8个不等,期望杂合度(he)的范围从0.523到0.908,多态信息含量(pic)的范围从0.375到0.842,详细结果展示在表7中。

  120黑异纹魮脂鲤微卫星标记位点及其在本属和近源属鱼类通用性应用